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<855> 散射光濁度法和透射光比濁法

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<855> 散射光濁度法和透射光比濁法

 

1.     介紹

散射光濁度法和透射光比濁法是基于光散射現象原理的分析技術。光散射是一種物理現象,其中光束由于與足夠小的物質粒子相互作用而改變其傳播方向(稱為偏轉)。根據麥克斯韋電磁理論,散射發生的先決條件是懸浮顆粒的折射率必須不同于懸浮液體的折射率。差異越大,散射越強烈。光散射有兩種類型:1)彈性散射,其中散射光和入射光的波長相同;2)非彈性光散射,其中散射光和入射光的波長不同。只有第一種光散射(彈性)與散射光濁度法和透射光比濁法有關。

在透射光比濁法中,測量透射光的強度,并在入射光方向(即0°)測量散射導致的入射光強度的衰減,并與入射光強度進行比較(空白測量)。被測特性是懸浮顆粒散射效應的間接測量,稱為濁度。懸浮樣品對光的任何吸收都會導致光強度的額外衰減(參見<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice)。因此,確保被測材料不會吸收測量波長處的光非常重要。實際上,控制吸收和濁度測定的方程式是相同的(盡管衰減常數的值不同)。在散射光濁度法中,測量與入射光傳播方向成90°角的散射光強度。因此,散射光濁度法濁度測量是對懸浮物散射效應的直接測量。

 

2. 術語和定義

描述濁度法和濁度法的常用術語包括:

濁度(符號S):由于懸浮顆粒的光散射效應,透射入射光束強度降低的一種度量。懸浮物的量可以通過觀察透射光(比濁法)或散射光(濁度法)來測量。

log I0/It = kbc = T

I0=入射光強度

It=透射光強度

k=摩爾濁度系數

b=樣品池路徑長度

c=濃度

T=濁度

濁度(符號,τ):在透射光濁度測量中,濁度是給定懸浮液的入射光束強度/單位長度減少的量度。國際標準化組織將濁度定義為“由于存在未溶解物質而導致液體透明度降低"。

濁度測量單位:渾濁度單位用一個描述符表示,該描述符指示測量方法。

散射光濁度計濁度單位(NTU):當使用散射光濁度法測量濁度時,濁度計以與入射光傳播方向成90°角的角度測量散射光,濁度單位稱為散射光濁度法濁度單位(NTU)。NTU的大小是根據初級福爾馬肼標準品(一種將硫酸肼和六亞甲基四胺溶液混合在水中制成的懸浮液)產生的濁度定義的。更安全的聚合物微珠懸浮液現已上市,并被公認為可接受的替代品。然而,所有這些標準都可以追溯到福爾馬肼。初級福爾馬肼標準溶液的濁度為4000 NTU。

其他公認的濁度單位包括福爾馬肼比濁法單位(FTU)和福爾馬肼濁度法單位(FNU)。這些單位相當于0-40 NTU范圍內的NTU。

 

3.     應用

透射光比濁法和散射光濁度法技術的應用包括1)溶液和/或懸浮液的濃度測定(通過在控制良好的反應參數下沉淀和懸浮產生的沉淀物,來測定幾種陽離子和陰離子);2)測量混濁溶液或懸浮液的濁度;3)測定分子量在1000到數億之間的多分散體系的重均分子量和尺寸;4)測量免疫分析的反應動力學或免疫沉淀動力學(比率散射濁度法);5)監測細胞和細菌的生長;6)懸浮物粒度分布測定、顆粒計數等。

比率散射濁度法廣泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它還用于重組生物制藥中的宿主細胞蛋白質鑒定。當使用該技術時,通過測量抗原-抗血清或抗原純化抗體復合物的光散射反應的變化,來計算導致免疫抗體-抗原沉淀反應或凝集反應的抗原(Ag)或抗體(Ab)的量。通??紤]抗原共價連接或吸附在聚合物微球上,以提高散射效率;由此產生的技術被稱為顆粒增強免疫分析"。雖然這項技術被稱為散射光濁度法,但通常散射光和透射光都是用比率儀器測量的。

散射光法濁度測量在低濁度范圍(散射介質濃度相對較低)更可靠。在該范圍內,觀察到樣品濃度與檢測器信號強度(以NTU表示)之間存在線性關系。隨著濃度的增加,多次散射的入射角也會增加,從而偏離線性響應。支持可靠線性關系的最大NTU值在1750–2000 NTU范圍內。透射光比濁法適用于更高的濁度范圍(散射介質的濃度)。為了獲得一致的結果,必須仔細控制所有測量變量。在可能的情況下,可以測量極稀的懸浮液。

 

4. 儀器儀表

用于透射光比濁法和散射光濁度法測量的儀器分別稱為透射光濁度計和散射光濁度計。通常,這些儀器包括一個帶有濾光器的汞燈(用于強綠線或藍線)、一個快門、一組具有已知透射率的中性濾光器和一個靈敏的光電倍增管,該光電倍增管可安裝在與入射光傳播方向成90°角的位置,或者在一個臂上,它可以圍繞溶液單元旋轉,并通過不透光外殼外的表盤設置為?135°+135°的任何角度。溶液池的形狀多種多樣,例如用于測量90°散射的正方形;45°、90°135°散射為半八角形;圓柱形可適用于所有角度的散射(見圖1)。

1.代表性濁度儀。注意,探測器2可安裝在可移動臂上。

濁度也可以用標準光電濾光光度計或分光光度計測量,最好是在光譜的藍色部分進行照明。散射光濁度法測量需要一個裝有光電管的儀器,以便接收散射光,而不是透射光。由于這與熒光計中使用的幾何結構相同,因此可通過適當選擇濾光片將其用作濁度計。比率濁度計結合了90°散射光濁度法和透射光比濁法。它包含光電管,接收和測量與樣品成90°角的散射光,以及接收和測量樣品前面的前向散射光。它還測量直接穿過樣品的光。通過90°角散射光測量值,前向散射光測量值和透射光測量值之和,計算兩者的比值,可獲得線性度。使用比率濁度測量系統的好處是雜散光的測量變得可以忽略不計。此外,彩色懸浮液的濁度測定僅使用透射光比濁法濁度儀或濁度儀(帶比率模式)進行,因為該程序補償了懸浮液顏色導致的光衰減。通常,這些儀器中的光源是鎢燈,在2700 K的燈絲溫度下工作,大部分光強約為550 nm。也可使用其他合適的光源。通常,探測器是硅二極管和光電倍增管。另一種消除顏色效應的方法是使用紅外發光二極管作為光源,其最大發射中心約為860 nm,光譜帶寬為60 nm。當激光光源也被使用時,尤其是在濁度測量儀器中,這種技術通常被稱為激光濁度測量"。使用激光散射光濁度計的優點是,在非常低的檢測水平下,信噪比顯著提高。通常光源是工作波長為660 nm的激光二極管。激光束的高功率密度使較小粒子產生更高的散射強度。與吸收未散射光的光阱相結合,該系統可顯著降低雜散光。當專著中的某個程序指示使用散射光濁度計或透射光濁度計時,可以使用在比率模式下工作的儀器。

 

5. 福爾馬肼濁度標準

福爾馬肼是目前已知的主要濁度標準。所有其他標準都是次要的,必須追溯到福爾馬肼。 主要標準在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲(ERR 1-May-2019)第 2 版(金書)中被定義為由用戶使用明確定義的方法和條件從可追溯的材料準備的標準。

福爾馬肼懸浮液有許多特點,以確保其適合作為主要標準。它可以從試劑級的起始材料中始終如一、準確地制備。該懸浮液由不同長度和隨機構型的聚合物組成,其組成的聚合物的形狀和尺寸從小于0.1 μm到大于10 μm不等。盡管聚合物鏈長分布已被證明因制備而異,但總的濁度結果是可以很好地重現的。

 

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福爾馬肼標準液的制備

硫酸肼溶液1.000 g ACS級硫酸肼(N2H4·H2SO4)溶解在100 mL A類容量瓶中中,并用無顆粒水稀釋至刻度。讓該溶液靜置4-6小時。

初級福爾馬肼標準液:2.50 g分析級六亞甲基四胺[(CH2)6N4]溶于25.0 mL無顆粒水中,裝入100 mL燒瓶。使用A25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液,并充分混合。使用前,讓制劑在25±1°的溫度下靜置48小時。由此產生的懸浮液可穩定運行2個月。

福爾馬肼儲備標準懸浮液1使用15 mL A類移液管,將15 mL福爾馬肼初級標準液轉移至1 L容量瓶中,并用無顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為60 NTU。

福爾馬肼儲備標準懸浮液2使用50 mL A類移液管,將50 mL福爾馬肼初級標準液轉移至200 mL容量瓶中,并用無顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為1000 NTU。

福爾馬肼參考懸浮液:根據表1,在100 mL容量瓶中混合各份福爾馬肼儲備標準懸浮液和無顆粒水,制備福爾馬肼參考懸浮液。




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